中华绒螯蟹Bco1基因的表达模式及其对高pH胁迫的响应

 
摘要：本文结合生物信息学、实时荧光定量PCR、原位杂交以及HPLC技术，研究了中华绒螯蟹Bco1基因特性及高pH慢性胁迫下 的响应。结果表明：Es-Bco1开放阅读框全长1614bp，编码537个氨基酸，属于RPE65超家族，并与三疣梭子蟹BCO1同源性高；该基因在多组织均有表达，于内膜、眼柄和肝胰腺高表达，蜕壳后期及卵巢发育I-III期的肝胰腺中表达显著升高。原位杂交结果显示，蜕壳AB期和卵巢发育III期时，其mRNA分别主要定位于肝胰腺的F细胞和R细胞。此外，高pH（9.0、10.0）胁迫30天后，幼蟹肝胰腺Es-Bco1表达水平上调，同时肝胰腺亮度值（L*）、黄度值（b*）及总类胡萝卜素、β-胡萝卜素含量显著降低。综上，Es-Bco1在中华绒螯蟹蜕壳与生殖发育时的肝胰腺组织中发挥作用，且参与高pH胁迫下肝胰腺中类胡萝卜素裂解代谢调控。

1 研究背景

  类胡萝卜素作为自然界广泛存在的天然色素，是生物体色彩多样性的重要物质基础。绝大多数动物无法自主合成类胡萝卜素，需通过摄食从外界获取。摄入体内后，类胡萝卜素通常需经类胡萝卜素裂解酶（CCO）转化为类维生素A及其他代谢物，才能发挥生理功能。然而，当前甲壳动物类胡萝卜素裂解酶的研究仍处于起步阶段。

中华绒螯蟹俗称河蟹，因蒸煮后甲壳呈现鲜红色、风味独特且营养丰富，深受消费者青睐。在室外池塘养殖过程中，大量换水、雨水注入、浮游生物种群更替及水体污染等因素，均会引起水体pH波动。研究表明，水体pH变化对河蟹生长发育影响显著：不同pH值会干扰幼蟹发育与非特异性免疫，导致肝胰腺白化、免疫力下降；同时，若饵料中类胡萝卜素缺乏，可能造成煮熟后壳色、卵巢及肝胰腺颜色浅淡，显著影响商品价值。

本研究聚焦中华绒螯蟹β-胡萝卜素裂解酶基因（Es-Bco1），解析其基因特征与预测结构，分析不同组织、蜕壳期及卵巢发育阶段的表达模式，定位其在肝胰腺中的表达区域，探究高pH慢性胁迫下肝胰腺中Es-Bco1表达、组织色泽及类胡萝卜素含量的变化，以揭示Bco1的生理功能及高pH对类胡萝卜素代谢的影响，为阐明甲壳动物类胡萝卜素分解代谢机制提供基础数据。

2 结果

2.1 中华绒螯蟹Bco1基因生物信息学分析

  中华绒螯蟹Bco1的ORF全长为1614 bp，编码537个氨基酸，预测分子量为60.69 ku，等电点为5.95，无跨膜区和信号肽，含4个外显子和3个内含子。19~529 aa处为CCO家族保守的RPE65结构域。序列比对显示，中华绒螯蟹与三疣梭子蟹BCO1的相似性最高，为73.08%，且他们均缺失LPKVA和KISS序列。系统发育树结果显示，中华绒螯蟹与三疣梭子蟹聚为一支，美洲螯龙虾和克氏原螯虾聚为另一分支。13个物种的BCO1均含Motif 1-6和Motif 8，软甲纲和线虫纲均缺失Motif 10，且均保留RPE65结构域。

2.2 Es-Bco1基因的组织特异性及时空表达分析

  Es-Bco1在河蟹的鳃、眼柄、内膜、肌肉、后肠、肝胰腺、胃和心脏中均有表达，其中内膜中相对表达量显著高于其他组织，眼柄和肝胰腺次之，心脏表达量最低。蜕壳周期中，肝胰腺Es-Bco1 mRNA表达呈动态变化：AB期最高，C期快速下降，D期降至最低水平，E期又显著回升。卵巢发育周期中，肝胰腺Es-Bco1 mRNA在I期和II期表达量较低，III期快速上升至最高，IV期显著下降，V期降至最低。

2.3 Es-Bco1在肝胰腺中的mRNA定位

  Es-Bco1在蜕壳AB期的肝胰腺中出现明显的阳性信号，且定位于纤维细胞（Fibrillar cell，F）和吸收细胞（Resorptive cell，R），且R细胞中的阳性高于F细胞。卵巢发育III期，肝胰腺中Es-Bco1 mRNA主要存在于F细胞。

2.4 高pH慢性胁迫对中华绒螯蟹肝胰腺Bco1基因表达、色泽及类胡萝卜素含量的影响

  河蟹在高pH胁迫30d后，随着pH的提高其肝胰腺中Es-Bco1mRNA呈现增加趋势，色泽参数L*、a*和b*值均显著下降。其中，pH 10.0组和pH 9.0组的L*和b*值显著低于pH 8.0组；pH 10.0组的a*值显著低于pH 8.0组。此外，肝胰腺中总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量随水体中pH升高而呈现显著下降趋势。其中，pH10.0组和pH9.0组的总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量显著低于pH8.0组。

3 研究意义

  本研究系统探究了中华绒螯蟹类胡萝卜素裂解酶基因的时空表达模式及环境胁迫响应规律，旨在：①解析甲壳动物类胡萝卜素分解代谢的分子机制；②为养殖过程中营养调控与环境优化提供理论依据，进而推动中华绒螯蟹养殖业的可持续发展。

4 作者简介

作者：熊静怡硕士

研究方向：甲壳动物营养生理

个人简介：上海海洋大学水产与生命学院2021级硕士研究生，专业为水产养殖，硕士学历，湖北荆州人，硕士期间主要从事甲壳动物类胡萝卜素裂解代谢机制的研究，已经以共同第一作者发表SCI论文2篇。

联系方式：1694528648@qq.com

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